Hanan R. Shehata1,2 *Anthony Kieffer3Wesley Morovic3 et Steven G.Newmaster1

  • 1Alliance de recherche sur les produits de santé naturels, Collège des sciences biologiques, Université de Guelph, Guelph, ON, Canada
  • 2Département de microbiologie, Faculté de pharmacie, Université de Mansoura, Mansoura, Égypte
  • 3IFF Health & Biosciences, International Flavors and Fragrances, Inc., Madison, WI, États-Unis

Les bienfaits des probiotiques pour la santé sont maintenant bien reconnus pour être spécifiques à la souche. La caractérisation et l'identification des souches probiotiques sont donc importantes dans la recherche clinique et dans l'industrie des probiotiques. Cela devient particulièrement important avec les rapports de produits probiotiques ne respectant pas la teneur en souche déclarée, compromettant potentiellement leur efficacité. La disponibilité de méthodes d'identification fiables est essentielle pour l'authentification des souches lors de la découverte, de l'évaluation et de la commercialisation d'une souche probiotique. Cette étude vise à développer des méthodes d'identification des souches Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 et Bi-07 (Bi-07™) basés sur la PCR en temps réel, ciblant les polymorphismes mononucléotidiques (SNP). Les SNP ont été ciblés par des tests PCR avec des sondes d'acide nucléique verrouillé (LNA), qui est une nouvelle application dans l'identification des probiotiques. Les tests ont ensuite été validés en suivant les directives de validation des tests PCR qualitatifs en temps réel. Chaque test a été évalué pour sa spécificité contre 22 souches non ciblées, y compris des souches étroitement apparentées Bifidobacterium animalis subsp. lactis souches et ont obtenu des taux de vrais positifs de 100 % et de faux positifs de 0 %. Pour déterminer la sensibilité et l'efficacité de la réaction, trois courbes standard ont été établies pour chaque souche. Les valeurs d'efficacité de la réaction étaient de 86, 91 et 90 % (valeurs R au carré > 0.99) et de 87, 84 et 86 % (valeurs R au carré > 0.98) pour B. animalis subsp. lactis Dosages DSM 15954 et Bi-07, respectivement. La limite de détection (LOD) était de 5.0 picogrammes et 0.5 picogrammes d'ADN pour les tests DSM 15954 et Bi-07, respectivement. Chaque test a été évalué pour sa précision à l'aide de cinq échantillons testés à trois concentrations d'ADN différentes et les deux tests se sont avérés hautement répétables et reproductibles. L'écart type des valeurs de Cq entre deux répétitions était toujours inférieur à 1.38 et inférieur à 1.68 pour les tests DSM 15954 et Bi-07, respectivement. Les tests se sont avérés applicables aux échantillons mono-souches et multi-souches ainsi qu'aux échantillons dans diverses matrices d'aliments ou d'ingrédients de compléments alimentaires. Dans l'ensemble, les méthodes ont démontré une spécificité, une sensibilité, une efficacité et une précision élevées et une large applicabilité aux types d'échantillons, de matrices et de machines. Ces méthodes facilitent l'identification au niveau de la souche des souches hautement monophylétiques B. animalis subsp. lactis DSM 15954 et Bi-07 pour garantir l'efficacité des probiotiques et fournir une stratégie pour identifier d'autres organismes probiotiques étroitement apparentés.

Introduction

Ces dernières années ont vu une augmentation significative des recherches scientifiques sur les probiotiques avec plus de 20,000 2019 publications en février XNUMX (Reid et al., 2019). Il y a également eu une augmentation rapide de la taille du marché mondial des probiotiques, qui était évalué à 48.88 milliards USD en 2019 et devrait atteindre 94.48 milliards USD d'ici la fin de 2027 (Fortune-Business-Insights, 2020). La croissance rapide de la recherche scientifique et de la taille du marché des probiotiques s'est accompagnée de rapports sur la non-conformité et la fraude dans les produits probiotiques (Morovic et coll., 2016Patro et coll., 2016Kolacek et al., 2017Shehata et Newmaster, 2020b,c). Une forme majeure de non-conformité dans les produits probiotiques est le non-respect des allégations sur l'étiquette du contenu des souches qui peuvent être rencontrées en tant que souches substituées, souches manquantes ou présence de souches non déclarées (Shehata et Newmaster, 2020b).

La caractérisation correcte des probiotiques a été identifiée comme l'un des critères permettant de qualifier un micro-organisme de probiotique (Binda et coll., 2020). Pour bien caractériser les probiotiques, il est important d'identifier et de nommer correctement les souches (Binda et coll., 2020). Un nom de souche peut être le numéro de catalogue d'une collection de cultures bien connue ou un nom de souche commerciale (Binda et coll., 2020). L'importance de l'identification au niveau de la souche est de plus en plus reconnue puisque les bienfaits des probiotiques pour la santé sont spécifiques à la souche, sauf preuve contraire (Klein et al., 2010McFarland et al., 2018). Compte tenu de la spécificité de la souche des bienfaits des probiotiques pour la santé, le groupe de travail conjoint de l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture et de l'Organisation mondiale de la santé (FAO/OMS, 2002) et le Conseil pour une nutrition responsable et l'Association internationale des probiotiques (Conseil-pour-une-nutrition-responsable-et-association-internationale-probiotiques, 2017) a recommandé que la désignation de la souche soit décrite sur les étiquettes des produits probiotiques. Cependant, la base moléculaire d'une « souche » n'a pas été bien définie. Une étude récente par un groupe d'experts en probiotiques a suggéré que les souches sont définies par une seule séquence génétique et qu'elles peuvent même être distinguées par des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) (Jackson et al., 2019). Ainsi, des méthodologies d'identification de souches fiables et hautement spécifiques sont un élément important de l'authentification et de l'évaluation de la qualité des probiotiques.

Des méthodologies ont été développées pour l'identification de plusieurs espèces et souches de probiotiques (Solano-Aguilar et coll., 2008Ahlroos et Tynkkynen, 2009Achilleos et Berthier, 2013Herbel et coll., 2013Morovic et coll., 2016Shehata et coll., 2020Shehata et Newmaster, 2020a). Ces méthodes sont des méthodes basées sur la PCR conventionnelle ou la PCR en temps réel (PCR quantitative, qPCR). Les méthodes basées sur la qPCR sont largement utilisées dans les diagnostics car elles sont rapides, sensibles, précises, permettent une surveillance en temps réel des réactions et éliminent le besoin de traitement post-PCR (Wilhelm et Pingoud, 2003). Cependant, la conception de tests qPCR spécifiques à une souche peut être difficile, en particulier lorsque la souche cible appartient à un taxon hautement isogénique tel que Bifidobacterium animalis subsp. lactis (Milani et coll., 2013). Une approche pour améliorer la spécificité de la réaction est l'utilisation d'acides nucléiques verrouillés (LNA) puisque le LNA s'annele à des séquences d'ADN complémentaires avec une stabilité thermique plus élevée et une sélectivité améliorée (Singh et al., 1998). Les tests LNA ont été utilisés dans des études antérieures pour permettre une spécificité jusqu'à une inadéquation d'une paire de bases (Singh et al., 1998Johnson et al., 2004), cependant, à notre connaissance, il n'a jamais été utilisé pour aider à identifier les probiotiques.

L'objectif de cette étude était de développer et de valider des méthodes de qPCR pour deux souches probiotiques cliniquement importantes ; souche Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 et souche Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bi-07™ (Bi-07). Le DSM 15954 présente plusieurs avantages pour la santé, notamment la prise en charge des coliques infantiles (Nocerino et coll., 2020), un rôle dans la réduction du risque d'infections des voies respiratoires dans la petite enfance (Taipale et coll., 2016), et un rôle dans l'amélioration de l'état parodontal (indice de plaque et indice gingival) chez les adultes en bonne santé lorsqu'il est administré par voie orale sous forme de pastilles avec L. rhamnosus GG (Toivainen et coll., 2015). Souche Bifidobacterium animalis subsp. lactis Il a été constaté que le Bi-07 réduisait l'incidence et la durée des symptômes du rhume et de la grippe (fièvre, incidence de la toux et durée de la rhinorrhée) chez les enfants en bonne santé (Leyer et coll., 2009), pour améliorer l'activité phagocytaire des granulocytes, améliorant ainsi les fonctions du système immunitaire chez les personnes âgées en bonne santé (Lehtinen et al., 2012), pour avoir des effets immunomodulateurs chez les adultes en bonne santé (Childs et al., 2014), pour contribuer à l'augmentation de la digestion du lactose chez les personnes souffrant de maldigestion du lactose (Turck et coll., 2020), et pour réduire la translocation bactérienne et la microinflammation chez les rats urémiques (Wei et al., 2014). Par conséquent, nous avons conçu des tests incorporant la technologie LNA pour ces deux souches cliniquement importantes.

Matériels et méthodes

Souches probiotiques de référence et extraction d'ADN

Un total de 13 échantillons de référence de Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954, 25 échantillons de référence de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bi-07, et 22 échantillons de référence non ciblés appartenant à d'autres espèces probiotiques ont été obtenus auprès d'International Flavors and Fragrances (anciennement DuPont Nutrition and Biosciences), Nature's Way Brands, Nature's Bounty, Jamieson Laboratories Ltd., Lallemand Health Solutions et UAS Labs (Tables 12). L'ADN a été extrait de 50 mg de chaque échantillon à l'aide du kit NucleoSpin Food (740945.50, Macherey Nagel, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant. La quantification de l'ADN a été réalisée à l'aide du fluorimètre Qubit 4.0 (Q33238, Life technologies). L'ADN a ensuite été stocké dans un congélateur à -20°C jusqu'à son utilisation.

TABLEAU 1

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Tableau 1. Échantillons utilisés pour évaluer la spécificité analytique des Bifidobacterium animalis subsp. lactis Test spécifique à la souche DSM 15954 et résultats des tests de spécificité analytique.

TABLEAU 2

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Tableau 2. Échantillons utilisés pour évaluer la spécificité analytique des Bifidobacterium animalis subsp. lactis Test spécifique à la souche Bi-07 et résultats des tests de spécificité analytique.

Conception du test qPCR

Pour concevoir des tests qPCR spécifiques à la souche, les variations de nucléotides dans les génomes de la souche cible par rapport aux souches étroitement apparentées doivent être identifiées pour être ciblées dans la PCR. Une nouvelle séquence génomique pour DSM 15954 a été générée à l'aide de matériel de culture obtenu auprès de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ). Le génome du DSM 15954 a été traité et séquencé comme décrit précédemment (Banerjee et coll., 2021) et a été soumis au National Center for Biotechnology Information (accession GenBank : CP085838, adhésion SRA : PRJNA773092).

Identifier et valider les variations de nucléotides dans les génomes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 (GenBank : CP085838) et Bi-07 (GenBank : CP003498.1) (Stahl et Barrangou, 2012), la fonction d'alignement NCBI et CLC Genomics Workbench 21.0.4 (QIAGEN Bioinformatics) Fixed Ploidy Variant Detection ont été utilisées avec les paramètres par défaut. Initialement, chaque souche était alignée sur le génome de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bl-04 (GenBank : CP001515.1). Les régions de séquence où des variations de nucléotides ont été identifiées ont été recherchées sur NCBI GenBank par rapport à toutes les séquences accessibles au public afin de confirmer le caractère unique des variations de nucléotides identifiées pour chaque souche cible. Des tests basés sur des sondes ont été conçus pour cibler les variations de nucléotides identifiées à l'aide de l'outil PrimerQuest (Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, IA, États-Unis). Amorces et sondes LNA (Tableau 3) ont également été commandés auprès d'IDT.

TABLEAU 3

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Tableau 3. Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 et Bifidobacterium animalis subsp. lactis Séquences d'amorce et de sonde spécifiques à la souche Bi-07.

Protocole qPCR

Toutes les amorces et les sondes ont été remises en suspension dans des solutions mères de 100 μM (IDT). La chimie du LNA a été positionnée dans les oligos sondes pour les deux tests (Tableau 3) comme décrit dans des travaux antérieurs chez les eucaryotes (Johnson et al., 2004). Les solutions de travail de toutes les amorces ont été préparées à 10 μM et les solutions de travail des sondes ont été préparées à 5 μM. Chaque mélange de réaction PCR (20 μl de volume total) consistait en 10 μl de 2x SensiFast Probes Master Mix (BIO-86020, Bioline), 4.4 μl d'eau de qualité biologie moléculaire, 1.8 μl de chaque amorce (10 μM), 1.0 μl de sonde (5 µM), et 1 µl d'ADN (la concentration d'ADN est indiquée ci-dessous pour les différentes expériences). Le protocole de fonctionnement de la PCR est le suivant : dénaturation à 95°C pendant 5 min et amplification (95°C pendant 10 s, et 66°C pendant 20 s pour B. animalis subsp. lactis DSM 15954, ou 95°C pendant 10 s, et 64°C pendant 20 s pour B. animalis subsp. lactis Bi-07) pour 40 cycles. Des contrôles négatifs sans matrice (NTC) ont été inclus dans chaque série. Tous les échantillons de toutes les expériences ont été testés en triple.

Validation de B. animalis subsp. lactis Dosages qPCR DSM 15954 et Bi-07

Les tests développés ont été validés en suivant les lignes directrices pour la validation des méthodes qualitatives de PCR en temps réel pour l'identification diagnostique moléculaire des probiotiques (Shehata et coll., 2019). Les tests ont été validés pour la spécificité, la sensibilité, l'efficacité, la répétabilité et la reproductibilité (Broeders et coll., 2014Shehata et coll., 2019). Toutes les réactions qPCR ont été exécutées sur le système de PCR en temps réel QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada), à l'exception des tests de reproductibilité qui ont été effectués sur QuantStudio 5 et Hyris bCUBE, une plate-forme qPCR portable.

Test de spécificité

Une étape essentielle de la validation du test qPCR consiste à confirmer la spécificité du test pour la souche cible. La spécificité du test a d'abord été évaluée in silico en recherchant les régions de séquence uniques identifiées sur GenBank à l'aide de la fonction nucléotidique de l'outil de recherche d'alignement local de base (BLAST). La spécificité du test a également été évaluée expérimentalement. Pour la souche DSM 15954, 13 échantillons cibles et 22 échantillons non cibles (Tableau 1) ont été utilisés, et pour la souche Bi-07, 25 échantillons cibles et 22 échantillons non cibles (Tableau 2) ont été utilisées (Shehata et coll., 2019). Pour confirmer la spécificité au niveau de la souche, étroitement liée Bifidobacterium animalis subsp. lactis les souches (HN019, Bl-04, B420, UABla-12 et HA-194) ont été incluses comme non cibles pour chaque test. Tous les échantillons ont été testés en qPCR comme décrit ci-dessus. L'ADN de tous les échantillons a été normalisé à 1 ng/μl. Chaque échantillon a été testé en trois exemplaires. Les taux de vrais positifs (rapport du nombre de positifs connus correctement classés au nombre total de positifs connus) et les taux de faux positifs (rapport du nombre de négatifs connus mal classés au nombre total de négatifs connus) ont été calculés (Commission du Codex-Alimentarius, 2010Shehata et coll., 2019).

Tests de sensibilité et d'efficacité

Une autre étape essentielle de la validation du test qPCR consiste à déterminer la sensibilité du test ou la limite de détection (LOD). Trois séries de dilutions d'ADN ont été utilisées pour chaque souche cible. La série de dilutions a été préparée par des dilutions en série de 10 à partir d'échantillons d'ADN de 10, 5 et 2 ng/μl. Chaque série de dilution consistait en 5 points de dilution (Bustin et coll., 2009). Chaque point de dilution a été testé en triple comme décrit ci-dessus. Pour évaluer l'efficacité du test, des courbes standard ont été établies entre les valeurs de Cq et la concentration logarithmique d'ADN dans Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis). Les valeurs de pente et de R au carré ont été déterminées à partir de la régression linéaire, et les valeurs de pente ont été utilisées pour calculer l'efficacité de la réaction.

Tests de précision

Pour déterminer la précision des essais développés, la répétabilité (variation intra-essai) et la reproductibilité (variation inter-essai) ont été évaluées. Cinq échantillons cibles à trois concentrations d'ADN différentes (0.01, 0.1 et 1 ng/μl) ont été testés en qPCR, sur deux jours différents pour déterminer la répétabilité, et sur deux plates-formes qPCR différentes (bCUBE et QuantStudio 5) pour déterminer la reproductibilité. Chaque échantillon a été testé en trois exemplaires.

Applicabilité des tests développés pour la détection des souches dans les compléments alimentaires finis et les produits alimentaires

L'applicabilité des tests développés pour la détection des souches dans les formes posologiques probiotiques finies et dans les produits alimentaires a été évaluée. Pour chaque souche cible, quatre échantillons contenant la souche cible ainsi que d'autres ingrédients couramment utilisés dans les compléments alimentaires finis, ainsi que 12 échantillons contenant les souches cibles ajoutées à diverses matrices alimentaires (Tableaux supplémentaires 12) ont été testés en qPCR comme décrit ci-dessus en utilisant de l'ADN normalisé à 1 ng/μl. Chaque échantillon a été testé en trois exemplaires.

Analyses statistiques

Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis) a été utilisé pour les affichages graphiques et les analyses statistiques. Le test de Kruskal-Wallis et le test de comparaisons multiples de Dunn ont été utilisés pour évaluer les effets de la matrice de l'échantillon sur les performances du test.

Resultats

Conception du test qPCR

Le roman Bifidobacterium animalis subsp. lactis Le génome DSM 15954 (BioSample : SAMN22442594) était un seul contig d'une taille de 1.94 Mbp et était identique à 100 % au génome BB-12 (GenBank : CP001853.2) (Jensen et al., 2021) à l'exception de plusieurs régions : des transposases répétées de la famille IS2001, une région intergénique et une alpha-glucosidase. L'inspection manuelle des alignements de lecture pour chaque région a montré que les polymorphismes étaient dus à des erreurs dans les régions répétitives, qui sont notoirement difficiles à assembler automatiquement (Loman et coll., 2015), et ont été corrigées manuellement. Des analyses bioinformatiques ont identifié un polymorphisme nucléotidique unique (SNP) dans chacun des génomes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 et Bi-07 (GenBank : CP003498.1) par rapport à des souches étroitement apparentées. Deux tests qPCR spécifiques à la souche ont été conçus pour cibler les SNP identifiés. Le test pour Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 amplifie un amplicon de 135 bp. La région cible code pour une histidine kinase. Le test pour Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bi-07 amplifie un amplicon de 123 pb et la région cible code pour une glycosyltransférase. Étant donné que les tests ciblent un seul SNP dans chaque souche, des sondes LNA ont été utilisées pour améliorer la sélectivité du test.

Évaluation de la spécificité des tests qPCR

La spécificité de chaque test a été évaluée in silico et expérimentalement. en silicone des tests de spécificité ont révélé que le SNP identifié dans Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bi-07 est unique à la souche Bi-07 par rapport à tous les autres Bifidobacterium animalis subsp. lactis souches déposées dans GenBank, en août 2021 (Figure 1A). En revanche, le SNP identifié dans Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 peut différencier la souche DSM 15954 de toutes les autres Bifidobacterium animalis subsp. lactis souches déposées dans GenBank, en août 2021, à l'exception des souches IDCC4301, BF052, RH et i797 (Figure 1B).

FIGURE 1

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Figure 1. Alignement de séquences multiples à partir du visualiseur d'alignement de séquences multiples NCBI 1.20.1. La séquence d'amplicons de (A) Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bi-07 et (B) B. animalis subsp. lactis Les tests DSM 15954 ont été recherchés sur GenBank à l'aide de la fonction blastn par rapport à la base de données de collection de nucléotides pour trouver des correspondances dans toutes les séquences génomiques accessibles au public. La séquence de la sonde est dans une boîte bleue et les bases d'acide nucléique verrouillées sont dans une boîte orange. Le polymorphisme nucléotidique unique (SNP) identifié dans Bi-07 était unique à la souche Bi-07 par rapport à tous les autres Bifidobacterium animalis subsp. lactis déposées dans GenBank, tandis que le SNP identifié dans le DSM 15954 était unique pour toutes les souches sauf IDCC4301, BF052, RH et i797, en août 2021.

Évaluer la spécificité de B. animalis subsp. lactis Le test spécifique DSM 15954 en qPCR a été réalisé en utilisant 13 B. animalis subsp. lactis Échantillons cibles DSM 15954 et 22 souches non cibles. Cinq des 13 échantillons cibles étaient des échantillons mono-souche et amplifiés à un Cq moyen entre 22.05 et 23.99 et moyenné à 22.88 (Figure 2A). Huit des 13 échantillons cibles étaient des échantillons multi-souches et amplifiés à un Cq moyen entre 22.55 et 27.05 et moyenné à 25.70 (Figure 2A). Aucun des échantillons non ciblés n'a été amplifié dans ce test, y compris les échantillons étroitement liés Bifidobacterium animalis subsp. lactis souches (Bi-07, HN019, Bl-04, B420, UABla-12 et HA-194) qui confirme la spécificité au niveau de la souche (Figure 2A).

FIGURE 2

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Figure 2. Évaluer la spécificité des tests spécifiques à la souche développés. (A) Bifidobacterium animalis subsp. lactis test DSM 15954 et (B) Bifidobacterium animalis subsp. lactis Dosage Bi-07. Le nombre d'échantillons cibles testés était de 13 et 25 pour les tests DSM 15954 et Bi-07, respectivement. Le nombre d'échantillons non ciblés testés était de 22 pour chaque essai. Chaque échantillon a été testé en trois exemplaires.

De même, évaluer la spécificité de B. animalis subsp. lactis Le test spécifique de Bi-07 en qPCR a été réalisé en utilisant 25 B. animalis subsp. lactis Bi-07 échantillons cibles et 22 souches non cibles. Quatre des 25 échantillons cibles étaient des échantillons mono-souche et amplifiés à un Cq moyen entre 19.19 et 21.40 et moyenné à 20.13 (Figure 2B). Vingt et un des 25 échantillons cibles étaient des échantillons multi-souches et amplifiés à un Cq moyen entre 23.24 et 27.87 et moyenné à 25.22 (Figure 2B). Aucun des échantillons non ciblés n'a été amplifié dans ce test, y compris les échantillons étroitement liés Bifidobacterium animalis subsp. lactis souches (DSM 15954, HN019, Bl-04, B420, UABla-12 et HA-194) qui confirme la spécificité au niveau de la souche (Figure 2B). Le taux de vrais positifs pour les deux tests était de 100 % et les taux de faux négatifs et de faux positifs étaient de 0 %.

Tests de sensibilité et d'efficacité

Trois séries de dilutions d'ADN préparées par des dilutions en série de 10 fois ont été utilisées pour déterminer les limites de détection et l'efficacité de la réaction. Des courbes standard ont été établies pour B. animalis subsp. lactis Test DSM 15954 avec des valeurs de pente de -3.71, -3.55 et -3.59 et des valeurs d'efficacité de réaction de 86, 91 et 90 % (Figure 3A). Les valeurs R au carré étaient de 0.997, 0.998 et 0.999. La LOD a été déterminée comme étant de 5 pg, correspondant à 2388 copies cibles. Des courbes standard ont été établies pour B. animalis subsp. lactis Test Bi-07 avec des valeurs de pente de -3.67, -3.77 et -3.71 et des valeurs d'efficacité de réaction de 87, 84 et 86 % (Figure 3B). Les valeurs R au carré étaient de 0.998, 0.982 et 0.993. La LOD a été déterminée à 0.5 pg, correspondant à 239 copies cibles.

FIGURE 3

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Figure 3. Évaluer la sensibilité analytique et l'efficacité des tests spécifiques à la souche développés. (A) Bifidobacterium animalis subsp. lactis test DSM 15954 et (B) Bifidobacterium animalis subsp. lactis Dosage Bi-07. Trois séries de dilutions de 10 fois ont été préparées à partir de trois concentrations d'ADN de départ (10 ng/μl, 5 ng/μl et 2 ng/μl). Chaque série de dilutions a été préparée à cinq points de dilution et chaque dilution a été testée en triple. Les limites de détection étaient de 5 pg, correspondant à 2388 copies cibles, et de 0.5 pg, correspondant à 239 copies cibles, pour les tests DSM 15954 et Bi-07, respectivement.

Tests de précision

La précision des deux dosages a été évaluée en déterminant la répétabilité et la reproductibilité. B. animalis subsp. lactis Le test DSM 15954 a été répété sur une courte période de temps pour déterminer la répétabilité. L'écart type des valeurs de Cq entre les deux essais variait de 0.02 à 0.24 pour 5 échantillons testés à 1 ng/μl, variait de 0.01 à 0.33 pour 5 échantillons testés à 0.1 ng/μl et variait de 0.03 à 1.38 pour 5 échantillons testés à 0.01 ng/µl (Figure 4A). La B. animalis subsp. lactis Le test DSM 15954 a été répété sur deux plates-formes qPCR différentes (Hyris bCUBE et QuantStudio 5) pour déterminer la reproductibilité. L'écart type des valeurs de Cq entre les deux essais variait de 0.39 à 0.75 pour 5 échantillons testés à 1 ng/μl, variait de 0.41 à 0.95 pour 5 échantillons testés à 0.1 ng/μl et variait de 0.03 à 0.61 pour 5 échantillons testés à 0.01 ng/μl (Figure 4A).

FIGURE 4

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Figure 4. Évaluer la répétabilité et la reproductibilité des tests spécifiques à la souche développés. (A) Bifidobacterium animalis subsp. lactis test DSM 15954 et (B) Bifidobacterium animalis subsp. lactis Dosage Bi-07. Cinq échantillons à trois concentrations d'ADN différentes (1 ng/μl, 0.1 ng/μl et 0.01 ng/μl) ont été utilisés. Chaque test a été répété un jour différent pour évaluer la répétabilité et a été répété sur une plate-forme de PCR en temps réel différente (bCUBE et QuantStudio 5) pour évaluer la reproductibilité.

De même, le B. animalis subsp. lactis Le test Bi-07 a été répété sur une courte période de temps pour déterminer la répétabilité. L'écart type des valeurs de Cq entre les deux répliques variait de 0.07 à 0.72 pour 5 échantillons testés à 1 ng/μl, variait de 0.16 à 1.02 pour 5 échantillons testés à 0.1 ng/μl et variait de 0.92 à 1.61 pour 5 échantillons testés à 0.01 ng/µl (Figure 4B). Le test a été répété sur deux plates-formes qPCR différentes (Hyris bCUBE et QuantStudio 5) pour déterminer la reproductibilité. L'écart type des valeurs de Cq entre les deux répliques variait de 0.05 à 1.68 pour 5 échantillons testés à 1 ng/μl, variait de 0.07 à 1.33 pour 5 échantillons testés à 0.1 ng/μl et variait de 0.31 à 1.52 pour 5 échantillons testés à 0.01 ng/µl (Figure 4B).

Applicabilité du test développé pour les produits pharmaceutiques finis et les produits alimentaires

Pour évaluer l'applicabilité des tests développés pour une utilisation avec des formes posologiques probiotiques finies et avec des produits alimentaires, quatre échantillons contenant la souche cible ainsi que d'autres ingrédients couramment utilisés dans les compléments alimentaires finis, et 12 échantillons contenant les souches cibles ajoutées aux matrices alimentaires ont été testés en utilisant les tests développés. Dans B. animalis subsp. lactis Test DSM 15954, tous les 16 échantillons amplifiés à des valeurs Cq allant de 22.55 à 26.79 (Tableau supplémentaire 1). En B. animalis subsp. lactis Test Bi-07, tous les 16 échantillons amplifiés à des valeurs Cq allant de 19.25 à 25.04 (Tableau supplémentaire 2). Les matrices alimentaires non inoculées avec des souches cibles ont été testées comme témoins négatifs pour chaque test spécifique à la souche, et aucune amplification n'a été observée à partir des matrices alimentaires avec les deux tests. Pour évaluer l'effet inhibiteur d'autres ingrédients ou matrices alimentaires sur les performances du test, 13 échantillons ayant la même composition de souche ont été comparés à un échantillon témoin sans ingrédients ni matrice alimentaire. Les tests de Kruskal-Wallis ont montré des différences significatives dans les valeurs de Cq (P-valeur = 0.0055 et 0.0049 pour les dosages DSM 15954 et Bi-07, respectivement. Cependant, le test de comparaisons multiples de Dunn a montré qu'il n'y avait pas de différence significative dans les valeurs de Cq entre l'échantillon de contrôle et l'une des matrices d'échantillons dans les deux tests, indiquant l'absence d'effet inhibiteur (Figure 5).

FIGURE 5

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Figure 5. Application des tests spécifiques à la souche développés dans diverses matrices de produits. Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 (A) et Bi-07 (B) ont été ajoutés à une variété de produits et de matrices alimentaires avant l'extraction de l'ADN. Les valeurs Cq des échantillons avec des matrices ont été comparées à la valeur Cq du contrôle de la culture uniquement pour évaluer une éventuelle inhibition de la PCR. Les barres représentées représentent la moyenne avec l'erreur standard de la moyenne (SEM). Aucune différence significative dans les valeurs de Cq n'a été observée entre l'échantillon témoin et l'une des matrices d'échantillons dans les deux tests (test de comparaisons multiples de Dunn), indiquant l'absence d'effet inhibiteur.

a lieu

B. animalis subsp. lactis DSM 15954 et Bi-07 sont deux souches probiotiques importantes ayant des effets bénéfiques potentiels sur la santé humaine. En règle générale, les produits probiotiques sont quantifiés à l'aide de techniques d'ensemencement de culture, qui sont généralement spécifiques à l'espèce ou au genre (Hansen et al., 2020). Bien que la définition d'une souche ne soit pas bien définie, les avantages pour la santé des probiotiques sont considérés comme spécifiques à la souche, sauf preuve contraire (Klein et al., 2010McFarland et al., 2018). Bien que tous les SNP n'aient pas un effet phénotypique, les SNP pourraient entraîner une mutation protéique ou un codon d'arrêt prématuré s'ils sont situés dans une région codante. De plus, les SNP intergéniques pourraient affecter les taux de transcription, ce qui pourrait entraîner des effets phénotypiques tels que la résistance aux antibiotiques (Morovic et coll., 2018). L'industrie des probiotiques étudie comment de petits changements dans les souches probiotiques telles que les SNP pourraient affecter les avantages cliniques pour la santé, ainsi que ce qui définit une «souche» (Jackson et al., 2019). L'objectif de la présente étude était de développer des méthodes fiables pour l'identification spécifique de ces deux souches pour une utilisation en laboratoire ou en recherche clinique ainsi qu'en diagnostic pour faciliter le contrôle de la qualité des produits probiotiques commerciaux. Le séquençage du génome est impératif pour établir des cibles pour le développement de tests qui, en raison de la base monophylétique de Bifidobacterium animalis soupçonner. lactis, n'étaient que des paires de bases de nucléotide unique pour cette étude. Les oligos LNA sont des analogues d'ADN et d'ARN avec une affinité accrue pour améliorer la sélectivité du test PCR qui ont été largement utilisés pour les études d'association à l'échelle du génome chez les eucaryotes (Johnson et al., 2004). Par conséquent, les oligos LNA ont été mis en œuvre dans les méthodes qPCR basées sur des sondes d'hydrolyse pour une identification simple, rapide et sensible des deux B. animalis subsp. lactis souches. Pour concevoir ces tests spécifiques à la souche, les génomes cibles ont été comparés à des souches étroitement apparentées pour trouver les SNP cibles et les tests ont ensuite été validés en suivant les directives pour déterminer la spécificité, la sensibilité, l'efficacité et la précision du test (Shehata et coll., 2019).

La spécificité de la qPCR ciblée est d'une importance primordiale pour confirmer qu'un test est capable de détecter sa séquence cible et pour éliminer la possibilité d'amplification et de résultats faussement positifs de souches non cibles étroitement liées à la souche cible (Bustin et coll., 2009). La spécificité a d'abord été évaluée in silico, qui a montré que le SNP ciblé dans Bifidobacterium animalis subsp. lactis Le test spécifique de la souche Bi-07 est unique à la souche Bi-07 par rapport à tous les autres Bifidobacterium animalis subsp. lactis souches. De même, le SNP ciblé dans Bifidobacterium animalis subsp. lactis Le test spécifique de la souche DSM 15954 peut différencier la souche DSM 15954 de toutes les autres Bifidobacterium animalis subsp. lactis souches déposées dans GenBank à l'exception des souches IDCC4301, BF052, RH et i797. D'autres analyses bioinformatiques et des tentatives de cibler une deuxième région du génome du DSM 15954 pour exclure ces quatre souches ont révélé qu'il n'y avait pas de SNP unique qui pouvait exclure les quatre souches. Des mises à jour fréquentes dans les bases de données de séquences avec des dépôts fréquents de nouvelles séquences peuvent nécessiter le développement de tests PCR supplémentaires ou l'ajout de cibles supplémentaires pour garantir la spécificité au niveau de la souche. La spécificité a également été évaluée expérimentalement pour chaque souche en utilisant diverses espèces et souches probiotiques apparentées (Tables 12). Fait remarquable, le rapport entre le nombre de positifs connus correctement classés et le nombre total de positifs connus (taux de vrais positifs) était de 100 % pour les deux tests. Le rapport entre le nombre de négatifs connus mal classés et le nombre total de négatifs connus (taux de faux positifs) était de 0 % (Commission du Codex-Alimentarius, 2010Shehata et coll., 2019). Cela montre que des souches probiotiques hautement identiques peuvent être distinguées sur la base d'une différence d'une seule paire de bases. Cependant, à mesure que de plus en plus de souches commerciales de la même espèce deviennent disponibles, de nouveaux tests qPCR peuvent devoir être développés pour la désignation de la souche.

Une autre étape importante de la validation d'un test consiste à évaluer la précision du test ou la variation technique en déterminant la répétabilité et la reproductibilité. La répétabilité mesure la concordance des résultats lorsqu'un test est répété indépendamment dans les mêmes conditions sur une courte période de temps (Kralik et Ricchi, 2017). La répétabilité a été déterminée pour chaque test à l'aide de cinq échantillons testés à trois concentrations et l'écart type des valeurs de Cq entre les deux réplicats était toujours inférieur à 1.38 pour B. animalis subsp. lactis Test DSM 15954 (Figure 4A) et était toujours inférieur à 1.61 pour B. animalis subsp. lactis Dosage Bi-07 (Figure 4B). Les résultats indiquent une précision élevée et une variation intra-essai minimale. La reproductibilité mesure la concordance des résultats lorsqu'un test est répété dans différentes conditions de laboratoire (Kralik et Ricchi, 2017). Les tests ont bien fonctionné à la fois sur le QuantStudio 5 standard et sur le bCUBE portable. La portabilité de bCUBE facilite les tests sur site en laboratoire ou hors laboratoire. Ces tests peuvent être encore optimisés et validés en tant que méthodes quantitatives pour la détermination du nombre viable dans les méthodes basées sur la qPCR ou la PCR numérique en gouttelettes (Hansen et al., 20182020Shehata et Newmaster, 2021). Cela nécessitera l'utilisation de colorants de viabilité pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes, et des travaux antérieurs ont montré que les colorants de viabilité doivent être optimisés pour chaque test (Kiefer et coll., 2020). Après avoir généré des courbes standard, les unités formant colonies (UFC) peuvent être interpolées en fonction des valeurs Cq.

Les tests développés ont également montré une efficacité et une sensibilité élevées. L'efficacité est définie comme le pourcentage de molécules cibles qui sont copiées dans un seul cycle de PCR (Lalam, 2006Svec et coll., 2015). Par conséquent, l'efficacité de la réaction est égale à 100 % si toutes les molécules cibles se dupliquent à chaque cycle. La méthode la plus fiable pour déterminer l'efficacité du test consiste à construire des courbes standard (Bustin et coll., 2009Svec et coll., 2015). L'efficacité de la réaction est alors calculée à partir de la pente de la courbe. Pour déterminer l'efficacité du test, des courbes standard ont été établies pour B. animalis subsp. lactis test DSM 15954 et B. animalis subsp. lactis Dosages Bi-07 utilisant trois séries de dilutions d'ADN pour chaque souche. Les valeurs d'efficacité de réaction pour les deux tests se situaient dans la plage d'efficacité de réaction acceptable pour un test PCR qualitatif en temps réel, qui varie de 80 à 120 % (Broeders et coll., 2014). La sensibilité d'un test est la quantité minimale de cible qui peut être détectée par le test et est généralement exprimée en LOD (Bustin et coll., 2009). La LOD a été déterminée à 5 pg pour B. animalis subsp. lactis test DSM 15954 et était de 0.5 pg pour B. animalis subsp. lactis Dosage Bi-07. Compte tenu de la faible LOD, les tests sont considérés comme très sensibles, ce qui est avantageux lors de la détection de souches cibles qui existent à de faibles niveaux dans des produits multi-souches.

Pour évaluer l'applicabilité des tests aux mélanges de plusieurs ingrédients, ce qui est courant dans les formes posologiques de compléments alimentaires finis, des échantillons multi-souches ont été testés en qPCR et tous les échantillons ont été amplifiés à une valeur Cq moyenne comprise entre 22.55 et 27.05 en B. animalis subsp. lactis Test DSM 15954 (Figure 2A et Tableau 1), et une valeur moyenne de Cq allant de 23.24 à 27.87 en B. animalis subsp. lactis Dosage Bi-07 (Figure 2B et Tableau 2). Il s'agit d'une amélioration par rapport à l'erreur standard typique du comptage sur plaque. Les tests sont applicables à la fois aux échantillons monosouches et aux échantillons multisouches et sont donc applicables à l'identification d'un seul ingrédient et d'un format fini. En outre, l'effet de matrice des ingrédients alimentaires et pharmaceutiques sur les performances du test a été évalué pour évaluer l'applicabilité des tests pour les produits alimentaires et pour les produits probiotiques formulés avec d'autres ingrédients tels que les formes pharmaceutiques finies. Tous les échantillons ajoutés à des aliments ou mélangés à des ingrédients ont été amplifiés avec succès (Tableaux supplémentaires 12). Des recherches antérieures ont montré que divers ingrédients alimentaires peuvent avoir un effet inhibiteur sur l'amplification PCR (Rossen et coll., 1992), qui met en évidence la nécessité de valider les tests chaque fois qu'une nouvelle matrice alimentaire est utilisée. Pour les deux tests, aucun effet inhibiteur de la PCR n'a été observé (Figure 5).

B. animalis subsp. lactis est largement utilisé dans l'industrie alimentaire et probiotique pour ses bienfaits pour la santé (Milani et coll., 2013). Cependant, ce taxon est de nature isogénique élevée, ce qui rend l'identification des souches un défi pour l'industrie utilisant B. animalis subsp. lactis souches dans leurs produits. Des études antérieures portant sur la conformité des produits probiotiques n'ont pas pu faire la distinction entre B. animalis subsp. lactis souches lorsque plusieurs souches coexistaient dans un produit (Morovic et coll., 2016Shehata et Newmaster, 2020b). Les méthodes d'identification spécifiques à la souche utilisant la technologie LNA pour distinguer les différences d'une seule paire de bases facilitent l'authentification de B. animalis subsp. lactis souches que ce soit dans des produits mono-souches ou multi-souches.

Conclusion

Avec la croissance rapide du marché des probiotiques, la disponibilité de méthodes d'identification des souches est importante pour faciliter l'authentification au niveau de la souche pour les chercheurs en probiotiques et l'industrie des probiotiques. Les tests développés pour l'identification spécifique des souches Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 et Bi-07 sont des méthodes basées sur la qPCR qui démontrent une spécificité, une sensibilité, une efficacité et une précision élevées. Les tests sont applicables aux échantillons mono-souche et multi-souche et également applicables aux échantillons dans une variété de matrices alimentaires ou mélangés avec des ingrédients pharmaceutiques. Les tests peuvent être utilisés sur une machine qPCR standard telle que le système de PCR en temps réel QuantStudio 5 ou sur une machine qPCR portable telle que bCUBE pour les tests sur site. Ces méthodes d'identification spécifiques à la souche offrant des performances exceptionnelles et une large applicabilité aux types d'échantillons, de matrices et de machines sont extrêmement précieuses pour l'authentification au niveau de la souche afin de soutenir la mission de conformité des produits probiotiques et d'assurer l'efficacité des probiotiques.

Déclaration de disponibilité des données

Les ensembles de données présentés dans cette étude peuvent être trouvés dans des référentiels en ligne. Les noms du/des référentiel(s) et le(s) numéro(s) d'accès peuvent être trouvés dans l'article/Matériel complémentaire.

Contributions d'auteur

HS a conçu l'étude, réalisé les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. AK et WM ont facilité l'acquisition des échantillons, fourni des commentaires précieux et édité le manuscrit. SN a aidé à concevoir l'étude, a facilité l'acquisition d'échantillons et a édité le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

Financement

Cette étude a été financée par la Natural Health Product Research Alliance (NHPRA) de l'Université de Guelph.

Conflit d'intérêts

AK et WM étaient employés par IFF Health & Biosciences, International Flavors and Fragrances, Inc., qui commercialise B. animalis subsp. lactis DSM 15954 et B. animalis subsp. lactis Bi-07.

Les autres auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d'intérêts potentiel.

Note de l'éditeur

Toutes les réclamations exprimées dans cet article sont uniquement celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement celles de leurs organisations affiliées, ou celles de l'éditeur, des éditeurs et des réviseurs. Tout produit pouvant être évalué dans cet article, ou toute réclamation pouvant être faite par son fabricant, n'est ni garanti ni approuvé par l'éditeur.

Remerciements

Nous remercions International Flavors and Fragrances, Inc., Nature's Way Brands, Nature's Bounty, Jamieson Laboratories Ltd., Lallemand Health Solutions et UAS Labs pour avoir aimablement fourni des échantillons de référence cibles et non cibles.

Matériel complémentaire

Le matériel supplémentaire pour cet article est disponible en ligne à l'adresse suivante: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.801795/full#supplementary-material

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Mots clés: PCR en temps réel, sonde d'acide nucléique verrouillée, spécifique à la souche, basée sur une sonde, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, probiotiques, authentification

Citation: Shehata HR, Kiefer A, Morovic W et Newmaster SG (2021) Sondes d'hydrolyse d'acide nucléique verrouillées pour l'identification spécifique de souches probiotiques Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 15954 et Bi-07™. De face. Microbiol. 12:801795. doi : 10.3389/fmicb.2021.801795

reçu: 25 October 2021; Accepté: 25 novembre 2021;
Publié le: 23 Décembre 2021.

Édité par:

Michael Ganzle, Université de l'Alberta, Canada

Commenté par:

Weilan Wang, Université de Calgary, Canada
Gabriel Vinderola, Facultad de Ingeniería Química, Universidad Nacional del Litoral (FIQ-UNL), Argentine

Droits d’auteur © 2021 Shehata, Kiefer, Morovic et Newmaster. Ceci est un article en libre accès distribué sous les termes de la Licence d'attribution Creative Commons (CC BY). L'utilisation, la distribution ou la reproduction sur d'autres forums est autorisée, à condition que le ou les auteurs et le (s) détenteur (s) des droits d'auteur soient crédités et que la publication originale dans ce journal soit citée, conformément à la pratique académique reconnue. Aucune utilisation, distribution ou reproduction n’est autorisée si elle n’est pas conforme à ces conditions.

*Correspondance: Hanan R. Shehata, [email protected]

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